بفرما مینوس جون اینا یادداشتای خودمه :
پلاسمید
در میکروبشناسی و ژنتیک، پلاسمید یک مولکول DNA است که جدا از DNA کروموزومی است و می تواند به طور مستقل، تکثیر شود. آنها دو رشته ای هستند و در بسیاری از موارد، حلقوی اند. پلاسمیدها معمولا به طور طبیعی در باکتری ها بوجود می آیند ، اما گاهی در موجودات یوکاریوتی یافت می شود (به عنوان مثال، حلقه 2- میکرومتری در ساکارومایسس سرویزیه). اندازه پلاسمید از 1 تا بیش از 1000 کیلوباز، متفاوت است. تعداد پلاسمیدهای مشابه در یک سلول واحد می تواند از یک تا هزار واحد تحت شرایط مختلف تغییر می کند. پلاسمیدها می توانند به عنوان بخشی متحرک در نظر گرفته شوند زیرا آنها اغلب با کانژوگاسیون ( پیوستگی ) _ یک مکانیسم انتقال ژن افقی _ همراه هستند . اصطلاح پلاسمید برای اولین بار توسط Lederberg Joshua زیست شناس آمریکایی در سال 1952 معرفی شد. پلاسمیدها به عنوان واحدهای همانند سازی در نظر گرفته می شوند ، که قادر به تکثیر خودکار در میزبان مناسب می باشد. پلاسمیدها در سه گروه عمده یافت می شوند: آرکه آ ها ( آرکی باکتر ها ) ، باکتری ها، و یوکاریوتها . پلاسمیدها مانند ویروس ها، یک فرم از حیات در نظر گرفته نمی شوند. بر خلاف ویروس ها، پلاسمیدها DNA خالص شده هستند و ژن های لازم برای روکش کردن مواد ژنتیکی برای انتقال به میزبان جدید را رمزگذاری نمی کنند ، هر چند برخی از انواع پلاسمیدها پیله جنسی لازم برای انتقال خود را رمز می کنند . انتقال میزبان به میزبان پلاسمید نیاز به انتقال مستقیم و مکانیکی دارد که به همراه پیوستگی و یا تغییر در بیان ژن میزبان است که باعث جذب عمدی عنصر ژنتیکی به همراه تغییر شکل می شود . تغییر شکل میکروبی با DNA پلاسمید نه انگلی است و نه همزیستی در طبیعت ، زیرا هر کدام مستلزم حضور یک گونه مستقل هستند که در یک حالت هم غذا یا مزاحم با ارگانیسم میزبان زندگی می کند. در عوض، پلاسمیدها با ارائه یک مکانیسم برای انتقال افقی ژن در داخل یک جمعیت از میکروب ها و به طور معمول یک مزیت انتخابی تحت یک وضعیت گرفته شده از محیط را ارائه می دهند .
پلاسمیدها به صورت آزاد در مخمر وجود دارند. یکی از انواع طبیعی پلاسمیدهای مخمر، پلاسمید ۲ میکرونی، نامیده میشود که از جمله از پلاسمیدهای حلقوی مخمر میباشد. این پلاسمید مخمری در حدود ۶۳۰۰ جفت باز دارد که تعداد کپی آن به ۵۰ کپی در نوکلئوپلاسم (فضای درونی هسته) میرسد. تقسیم این پلاسمیدها وابسته به کروموزوم مخمر نمی‌باشد و احتمالا پروتئینهای لازم برای همانند سازی را خود کد میکنند. گروه دیگری از پلاسمیدهای حلقوی مخمر پلاسمیدهای اپیزومی مخمر نامیده میشوند.
بیشتر باکتری‌ها دارای پلاسمیدهایی می‌باشند که به آنها ویژگی‌های تازه‌ای مانند مقاومت به یک آنتی‌بیوتیک خاص، مصرف نوعی قند یا اسید آمینه، تولید رنگدانه، بیماریزایی، تجزیه هدروکربن‌ها یا مولکول‌های پیچیده شیمیایی و ... می‌دهد. یک ویژگی برجسته پروکاریوت‌ها، توانایی آنها در تبادل بسته‌های کوچک اطلاعات ژنتیکی است . این اطلاعات به صورت پلاسمیدها منتقل شوند. در بعضی موارد، پلاسمیدها ممکن است از یک سلول به سلول دیگری منتقل شده و بنابراین مجموعه‌ای از اطلاعات ژنتیکی تخصص یافته را درون یک جمعیت انتقال دهند. بعضی پلاسمیدها میزبان‌های زیادی دارند که آنها را قادر می‌سازد مجموعه‌ای از ژنها را به باکتری‌های مختلف منتقل کنند. در باکتری، پلاسمیدها می‌توانند از یک باکتری به باکتری دیگر منتقل شوند و به همراه این انتقال ویژگی‌های باکتری نیز منتقل میشود. مثلا یک باکتری که مقاوم به پنی سیلین نبوده در اثر دریافت یک پلاسمید که ژن مقاومت به پنی سیلین را داراست، به این آنتی‌بیوتیک مقاوم میشود یا یک باکتری که بیماریزا نبوده، در اثر دریافت یک پلاسمید، بیماریزا میشود.
با تغییراتی که در توالی پلاسمیدها ایجاد میکنند ویژگی‌هایی در آنها بوجود می‌آید که در مهندسی ژنتیک استفاده میشوند. معمولاً به پلاسمیدهایی تغییر یافته ژنتیکی وکتور می‌گویند.
پلاسمید در سلولهای گیاهی در اثر عفونت با باکتری آگروباکتریوم وارد میشود. امروزه از اینگونه پلاسمیدها، پس از انجام تغییراتی بر روی آنها، برای انجام مهندسی ژنتیک در گیاهان، استفاده میشود.
اجزای تشکیل دهنده ی پلاسمید :
Ti پلاسمید
همه جنبه های دستکاری ژنتیکی سلول های گیاهی به آسانی انجام نمی شوند. گیاهان نه تنها دارای مقدار زیادی مواد کروموزومی هستند و در مقایسه با سلول های تک که در آزمایشگاه رشد کرده نسبتا به آرامی رشد می کنند ، بلکه تعداد کمی ناقل شبیه سازی می توانند با موفقیت در سلول های گیاهی عمل کنند . در حالی که محققان با کار بر روی سلول های حیوانی می توانند برای پیدا کردن تنها یک مورد در میان طیف گسترده ای از ناقل های شبیه سازی انتخاب کنند ، در حال حاضر محققان در حوزه گیاهی محدود به تعداد کمی انواع پایه از ناقلین هستند . شاید رایج ترین ناقل شبیه سازی گیاهی مورد استفاده ، Ti پلاسمید یا همان پلاسمید القای تومور باشد . این پلاسمید در سلول های نوعی باکتری به نام Agrobacterium tumefaciens یافت می شود که به طور طبیعی درون خاک زندگی می کند . این باکتری قادر به ورود به سلول های گیاه و القای نوعی سرطان به نام گال طوقه ای (crown gall ) می شود که باعث ایجاد توده ای متورم در محل زخم ها ( مثلا یک خراش ) خواهد شد . ظرفیت القای تومور توسط این باکتری بخاطر حضور Ti پلاسمید است . Ti پلاسمید به خودی خود، یک مولکول DNA بزرگ، مدور و دو رشته ای است که می تواند به طور مستقل از ژنوم A. tumefaciens تکثیر شود. هنگامی که این باکتری یک سلول گیاهی را آلوده می کند ، یک قطعه 30000جفت بازی از Ti پلاسمید - به نام T DNA - از پلاسمید جدا شده و وارد ژنوم سلول میزبان می شود. این جنبه از عملکرد Ti پلاسمید آن را به عنوان یک ناقل شبیه سازی گیاهی ، مفید ساخته شده است. T-DNA یا DNA منتقل شونده در منطقه T[4] بر روی پلاسمید Ti یا Ri قرار دارد. اندازه منطقه T در پلاسمیدهای طبیعی Ti و Ri حدوداً 10 تا 30 کیلو باز است. بنابراین، منطقه T عموماً 10 درصد پلاسمید Ti را شامل میشود. برخی پلاسمیدهای Ti یک منطقه T داشته و برخی دارای چند منطقه T می باشند. فرآیند انتقال T-DNA از پلاسمید Ti و ارسال آن از باکتری به سلول گیاهی حاصل فعالیت ژن های بیماری زا (vir) می باشد که توسط پلاسمید Ti حمل میشوند.
منطقه T با توالی های حاشیه ای T-DNA معین می شود. این حاشیهها 25 جفت باز طول دارند و از نظر توالی بسیار همسان هستند. آنها منطقه T را با تکرارهای هم جهت از دو طرف در بر گرفته اند. به طور کلی، کناره های T-DNA حدود آن را تعیین میکنند ( البته موارد استثنایی نیز وجود دارد که به آنها اشاره خواهد شد) ، چون این توالی ها هدف اندونوکلئازهای اختصاصی کناره ها یعنی VirD1/VirD2 که T-DNA را Ti plasmid جدا می کنند، می باشند. به نظر میرسد که یک قطبیت در کناره های T-DNA وجود دارد به طوری که در ابتدا به نظر می رسد کناره راست بسیار مهمتر از کناره چپ است. عوامل متعددی باعث ایجاد این قطبیت می شوند. اول اینکه توالی های حاشیه ای فقط به عنوان هدف اندونوکلئاز VirD1/VirD2 عمل نمی کنند بلکه به عنوان یک محل اتصال کووالانت به پروتئین VirD2 نیز عمل می کنند. در پلاسمید Ti و Ri ( یا در ناقل های دوتایی T -DNA [5] ) کناره های T-DNA باعث به هم وصل شدن DNA دورشته ای می شود. شکستن این توالی های کناره ای دورشته ای شده هم در شرایط in vivo و هم in vitro، نیازمند پروتئی های VirD1 و VirD2 میباشد، هرچند در شرایط in vitro پروتئین VirD2 به تنهایی میتواند یک توالی تک رشتهای حاشیه ای T-DNA را ببرد. شکتن توالی حاشیهای 25 جفت بازی T-DNA عمدتاً با ایجاد شکافی در "رشته پایینی" T-DNA به طور قراردادی، بین نوکلئوتید 3 و 4 صورت میگیرد. شکستن دورشتهای نیز در کناره های T-DNA گزارش شده است. ایجاد شکاف در توالی حاشیهای با پیوستگی محکم (شاید کووالانت) پروتئین VirD2 از طریق تیروزین موقعیت 29 با انتهای 5' مولکول تک رشته ای حاصل از T-DNA که رشته T[6] خوانده می شود، همراه است. این رشته T است که به جای مولکول دورشته ای T-DNA، به سلول گیاهی منتقل می شود. در این حالت، این پروتئین VirD2 است که به حاشیه راست متصل شده (مستقیماً به خود توالی حاشیه متصل نمیشود) و باعث ایجاد قطبیت و اهمیت حاشیه راست نسبت به حاشیه چپ می شود. ذکر این نکته لازم است که چون شکاف در حاشیه چپ نیز برای اتصال VirD2 به بقیه مولکول لازم است (قسمت غیر T-DNA پلاسمید Ti یا ناقل دوتایی T-DNA) [7]، این موضوع ممکن است باعث فرآیند جداسازی رشته T از پلاسمید Ti یا پلاسمید Ri و ناقلین دوتایی T-DNA باشد. مشکل انتقال "بقیه قسمت های"4 ناقل به گیاه در ادامه شرح داده خواهد شد.
دوم اینکه شاید حضور توالی های overdrive T-DNA نزدیک به حاشیه راست بسیاری از T-DNAها، نیز به ایجاد قطبیت بین حاشیه چپ و راست کمک نماید. توالی های overdrive باعث تقویت انتقال رشته T به گیاهان می شوند، گرچه هنوز سازکار مولکولی این موضوع ناشناخته است. گزارشهای اولیه حاکی از این است که پروتئین VirC1 به توالی overdrive متصل می شود و شاید بریده شدن حاشیه T-DNA توسط اندونوکلئاز VirD1/VirD2 را تقویت کنند. عمل VirC1 و virC2 برای بیماری زایی بسیار مهم است و جهش این دو ژن باعث عدم بیماری زایی در بسیاری از گونه های گیاهی می شود. اما گزارش هایی ارائه شده که تولید T-DNA در جهش یافته های ژن virC آگروباکتریوم را در سطح گونه وحشی دانسته اند. بنابراین هر گونه اثر virC پس از پردازش T-DNA رخ می دهد.
Ti پلاسمید می تواند برای نقل و انتقال یک ژن با منشا خارجی به سلول های گیاه میزبان استفاده شود. این نوع از انتقال ژن نیازمند دو مرحله است: 1) ژنهای القای تومور با منشأ درونی DNA T ، باید غیر فعال شوند و 2) ژنهای خارجی باید در همان منطقه از Ti پلاسمید داخل شوند.
پلاسمید نوترکیب حاصل ، تا حدود 40000 جفت باز از DNA وارد شده را حمل می کند که شامل توالی های مناسب تنظیمی گیاهی است و پس از آن می تواند به سلول های A. tumefaciens بازگردانده شود. این سلول باکتری می تواند معرفی شود به پروتوپلاست های سلول گیاهی یا با فرآیند عفونت و یا با تزریق مستقیم . درون پروتوپلاست ، DNA خارجی، متشکل از هر دوی T DNA و ژن تزریق شده ، به داخل ژنوم گیاه میزبان وارد می شود. پروتوپلاست مهندسی شده - حاوی DNA T نوترکیب - بازسازی می شود در کل گیاه ، که هر سلول آن که حاوی ژن وارد شده است. هنگامی که یک گیاه DNA T را با ژن وارد شده اش ترکیب می کند ، آن را به نسل های آینده گیاه با یک الگوی طبیعی توارث مندلی منتقل می کند. یکی از اولین آزمایش ها که درگیر حمل و نقل یک ژن خارجی توسط Ti پلاسمید بود شامل قرار دادن یک ژن جدا شده از یک گیاه از خانواده حبوبات به داخل یک گیاه میزبان تنباکو بود. اگر چه این آزمایش در خدمت هیچ هدف تجاری مفیدی نبود ،ولی با موفقیت توانست توانایی Ti پلاسمید را برای حمل ژنها به داخل سلولهای گیاه میزبان - جایی که آنها می توانند گنجانیده و بیان شوند- اثبات کند .
واقعیت این است که تنها انواع خاصی از گیاهان به طور طبیعی مستعد ابتلا به عفونت با ارگانیسم های باکتریایی هستند که اصولا سودمندی آنها محدود به Ti پلاسمید به عنوان ناقل شبیه سازی است. در طبیعت، A.tumefaciens تنها گیاهان دو لپه ای با دو برگ جنینی را آلوده می کند . گیاهان دولپه ای به حدود 170.000 گونه مختلف تقسیم می شوند ، شامل : رز ، سیب ، سویا ، سیب زمینی ، گلابی تنباکو . متاسفانه ، بسیاری از گیاهان زراعی مهم ، از جمله ذرت، برنج، و گندم، تک لپه هستند – گیاهانی با تنها یک برگ جنینی - و در نتیجه نمی توانند به راحتی با استفاده از این باکتری تراریخته شوند.
تلاش های پژوهشی در چند سال گذشته محدودیتهای A. tumefaciens را کاهش داده است. دانشمندان کشف کردند که با استفاده از فرایندهای از ریز تزریقی (microinjection ) ، ایجاد منفذ بوسیله الکتریسیته (electroporation ) ، و بمباران ذره ای (particle bombardment ) ، مولکول های DNA خالص می توانند به انواع سلول های گیاهی که مستعد ابتلا به A. tumefaciens نیستند ، معرفی شوند. ریز تزریقی شامل تزریق مستقیم مواد به داخل سلول میزبان با استفاده از یک سوزن میکروپیپت که به طور ظریفی طراحی شده ، می باشد. در الکتروپوریشن ( ریز تزریقی ) از پالس های کوتاه برق با ولتاژ بالا برای القاء تشکیل منافذ انتقال در غشاء سلول میزبان استفاده می شود . چنین منافذی به نظر می رسد که به عنوان راه های عبورکه از طریق آنها DNA می تواند وارد سلول میزبان شود ، عمل می کنند. بمباران ذره ای در واقع گلوله های میکروسکوپی پوشش داده شده با DNA را از خلال دیواره یک سلول گیاهی شلیک می کند. این پیشرفت ها در برنامه های تجاری مهندسی ژنتیک گیاهی، ارائه محصولات غذایی با ارزش از ذرت، برنج و گندم مستعد ابتلا به انواع مختلف دستکاری توسط تکنیک های DNA نوترکیب و بیوتکنولوژی ، اهمیت دارد .
نقشه ژنتیکی Ti پلاسمید :
شکل 1: شمای یک پلاسمید Ti نوع octopine (A) و ناحیه T-DNA این پلاسمید (B).
A) T-DNA به سه ناحیه T-DNA چپ (TL)، T-DNA مرکزی (TC) و T-DNA (TR ) راست تقسیم میشود. دایرههای توپر سیاه نشانه توالیهای تکراری حاشیه T-DNA هستند. oriV نقطه شروع همانندسازی پلاسمیدTi با دایره توخال نمایش داده شده است.
B) رونوشتهای متنوع رمزشده توسط T-DNA در پلاسمید Ti و جهت رونویسی آنها با بردارها نمایش داده شده است. ژنها رمزکننده فعالیتهایی شامل ساخت اکسین (auxin)، ساخت سایتوکینین (cyt)، مانوپین mas) ) و آگروپین aga) ) نشان داده شدهاند.
[1] Rhizogenic
[2] Mannopine
[3] Agropine
[4] T-region
[5] Binary Vector
[6] T-strand
[7] Backbone
منابع :
http://www.acces***cellence.org/RC/AB/BA/Transforming_Plants.php
http://kasra13.persianblog.ir/post/179
http://fa.wikipedia.org/wiki/پلاسمید
http://en.wikipedia.org/wiki/Plasmid
