معتبر ترین وجدید ترین متد های کشت بافت به همراه مباحث آزمایشگاهی ... دکتر مهدی شاهسوند

[hortilover]

تعریف کشت بافت
به کشت قطعه ای از بافت گیاه در شرایط آزمایشگاهی و کاملا استریل، کشت بافت یا کشت درون شیشه ای(invitro) می گویندکه در نهایت از این قطعه ، یک گیاه کامل به دست می آید.اصطلاح invitro در برابر اصطلاح invivo (کشت در فضای آزاد) می باشد.
تاریخچه کشت بافت: سابقه کشت بافت حدودا به یک قرن پیش باز می گرددو اساس کشت بافت به تئوری شیلدن و شوان مربوط می شود. بر اساس این تئوری، هر سلول از موجود زنده اگر در شرایط مطلوب قرار گیرد ، به یک گیاه کامل تکامل می یابد. این خاصیت Toti potency نامیده می شود.بعد از آن دانشمندان بر اساس همین تئوری به موفقیت هایی دست یافتند.

اهمیت و کاربرد کشت بافت در باغبانی
1)تولید گیاهان عاری از ویروس و بیماری.
2)تکثیر و ریز ازدیادی گیاهان (Micropropagation) .
3)تولید گیاهان هاپلوئید و سپس دیپلوئید کاملا هموزیگوس از طریق کشت میکروسپور یا بساک.
4)دست ورزی ژنتیکی و دورگ گیری سوماتیکی با استفاده از الحاق پروتوپلاسمی و همچنین ایجاد تلاقی بین گونه ای در شرایط درون شیشه ای.
5)کشت سوسپانسیون سلولی و تولید متابولیت های اولیه مثل قند وکربن و نیز متابولیت های ثانویه.
6)ایجاد گیاهانی با خصوصیات جدید با استفاده از تنوع سوماکلونال.
7)نجات جنین با استفاده از کشت جنین های نارس در تلاقی بین گونه ای.
8)نگهداری ژرم پلاسم گیاهان در شرایط درون شیشه ای.
9)استفاده از کشت بافت در انتقال ژن به گیاهان.
10)استفاده در مطالعات بافت شناسی ، سلول شناسی ، و فیزیولوژی گیاهی .

انواع کشت بافت
· کشت بذر
· کشت جنین
· کشت کالوس
· کشت اندام ( برگ ، ریشه ، ساقه ، مریستم و دانه گرده )
· کشت سوسپانسیون سلولی
· کشت پروتوپلاست

محیط کشت (Medium)
در شرایط آزمایشگاهی به اولین چیزی که نیاز داریم یک بستر مناسب برای رشد گیاه می باشد ، به این بستر اصطلاحا محیط کشت می گویند.در محیط کشت کلیه مواد غذایی زیر وجود دارد:
ü عناصر ماکرو
ü عناصر میکرو
ü هیدرات های کربن یا قند ها
ü ویتامین ها
ü هورمون ها
ü اسید های آمینه همچون گلایسین و ترکیبات پیچیده مثل پپتون
ü هیدرولیزات کازئین
ü شیر نارگیل
ü پلی آمین
ü آگار
ü آب
عناصر ماکرو: این مواد به مقداری بیش از 0.5 میلی مول بر لیتر ، مورد نیاز گیاه می باشند. این عناصر شامل :Ca , MgSN , P , K , می باشند. معولا عناصر معدنی ماکرو به صورت استوک ساخته و در یخچال نگهداری می شوند. در تهیه استوک باید دقت شودکه مواد ترکیب شده ، تشکیل رسوب ندهند. به عنوان مثال در بین عناصر ماکرو، منیزیوم را معمولا به صورت استوک جداگانه تهیه می کنند.
نقش عناصر ماکرو در محیط کشت
نیتروژن: در ساختمان پروتئین ها ، نوکلئوتید ها ، برخی کوانزیم ها وجود دارد.
فسفر: در ساختمان اسید های نوکلئیک ، ATP و مواد حد واسط فتوسنتز وتنفس وجود دارد.
پتاسیم: مهمترین کاتیون تنظیم کننده فشار اسمزی در سلول می باشد.
کلسیم: در بیوسنتز دیواره سلولی موثر است.
منیزیوم: در ساختمان کلروفیل نقش دارد و به عنوان کوفاکتور عمل می کند. [ فعال کننده آنزیم را کوفاکتور گویند که ممکن است ماده ای آلی یا معدنی باشد.]
گوگرد: در ساختمان اسید های آمینه مثل سیستئین و متیونین ( پیش ماده سنتز اتیلن ) نقش دارد و در ساختمان برخی کوانزیم ها دیده می شود.
عناصر میکرو
این مواد به مقداری کمتر از 0.5 میلی مول بر لیتر مورد نیاز گیاه می باشند.این عناصر شاملFe , Mn , Cu , B , Zn , Co , I , Mo می باشند.در میان این عناصر فقط آهن به صورت استوک جداگانه و بقیه عناصر به صورت یک استوک (استوک میکرو) ساخته می شود.
ادامه......

[hortilover]

معمولا استوک آهن درون فویل پیچیده می شود زیرا نور تجزیه کننده آهن است. محلول استوک نمک های میکرو همانند استوک نمک های ماکرو برای کوتاه مدت در یخچال قابل نگهداری است. و برای نگهداری طولانی مدت ، از فریزر استفاده می شود.
نقش عناصر میکرو در محیط کشت
مس: به عنوان کوفاکتور عمل می کند و در واکنش های زنجیره انتقال الکترون نقش دارد.
روی: در بیوسنتز کلروفیل و هورمون اکسین موثر است و به عنوان کوفاکتور نیز عمل می کند.
آهن : در زنجیره انتقال الکترون موثر است.
منگنز: به عنوان کوفاکتور عمل می کند.
مولیبدن: به عنوان کو فاکتور عمل می کند و در ساختمان برخی آنزیم ها دیده شده است.
کبالت : در ساختمان برخی ویتامین ها مثل B12بکار رفته است.
ید: به دلیل سمیت ، کاربرد زیادی در کشت بافت ندارد.
بور: به عنوان کوفاکتور عمل می کند.
قندها یا هیدرات های کربن
به دلیل نور کم در محیط درون شیشه ای، فتوسنتز چندانی صورت نمی گیرد، لذا افزودن قند در محیط کشت کاملا ضروری است. معمولا از قند ساکاروز ، فروکتوز و گلوکز استفاده می شود. میزان غلظت قند افزوده شده به محیط ، بستگی به نوع ریز نمونه (Explant) و سن آن دارد. مثلا جنین های جوان به درصد بالاتری قند نیاز دارند. نکته مهمی که باید توجه کرد اینست که قند ها در اثر اتوکلاو نمودن، دچار تغییر می شوند.
ویتامین ها
اکثر ویتامین ها توسط گیاه ساخته می شود؛ لیکن اضافه نمودن برخی از ویتامین هانظیر اسید نیکوتینیک(B3) ، تیامین (B1) ، پیرودوکسین (B6) و... به محیط کشت ضروری است. همچنین از ویتامینC به عنوان آنتی اکسیدان استفاده می شود. ویتامین ها معمولا به صورت استوک100X ( یعنی صد برابر) تهیه می شوند عموما ویتامین ها را توسط صافی ، استریل می کنند و از اتوکلاو (به دلیل حساسیت ویتامین ها به گرما) استفاده نمی شود.
هورمون ها
معمولا هورمون ها در ایجاد تمایز و شکل گیری اندام ها موثر هستند، مهمترین هورمون های گیاهی که در کشت بافت استفاده می شوند عبارتند از : اکسین ، سیتوکینین ، جیبرلین. البته گاهی هم از آبسزیک اسید استفاده می گردد. سیتوکینین از مهمترین هورمون ها در تمایز بافت ها می باشد. استفاده از جیبرلین ، محدود به کشت جنین است چون جیبرلین از اندام زایی( ارگانوژنز) جلوگیری می نماید. اکسین کاربرد زیادی در کشت بافت دارد و شامل IAA ( اکسین طبیعی که به دلیل ناپایداری در مقابل نور و دما ، درون فویل نگهداری می شود) ، NAA ، IBA، 2,4,D ( از 2,4,D استفاده چندانی در کشت بافت نمی شود چون این ماده سبب ایجاد موتاسیون می کند ونیز مانع فتوسنتز می باشد ، ولیکن از 2,4,D در القا جنین زایی سوماتیکی بهره می گیرند.

آزمایشگاه کشت بافت
عموما یک آزمایشگاه کشت بافت از چهار قسمت تشکیل شده است :
1) اتاق تهیه محلول ها و محیط کشت و نگهداری مواد و همچنین قسمت شستشوشوی ظروف
2) اتاق مخصوص ریزنمونه ها یا Explants .
3) اتاق نگهداری و رشد گیاه کشت شده در محیط کشت، که اصطلاحا به آن گراس چمبر می گویند. نور ، دما و رطوبت در این محل کاملا کنترل شده میباشد.
گلخانه کوچک سرپوشیده که آخرین مکان نگهداری ریز نمونه ها می باشد
http://i39.tinypic.com/282429y.jpg

[hortilover]

اکسینها ، عموما به منظور افزایش رشد سلول ها و همچنین تولید اندام و یا القای جنین زایی سوماتیکی و یا القای کالوس به کار می رود. در حین تولید اندام نسبت مناسب اکسین به سیتوکینین باید رعایت شود. میزان اکسین با غلظت کمتر ( نسبت به سیتو کینین) تولید ساقه، نسبت بیشتر اکسین ( نسبت به سیتوکینین) تولید ریشه می کند.اگر غلظت اکسین خیلی زیاد باشد، تولید اندام نمی کند بلکه کالوس تولید می شود.



◙ نکته مهم: به منظور تهیه استوک اکسین ، بهتر است که اکسین ها را در هیدروکسید سدیم یا هیدروکسید پتاسیم 0.1 مولار ابتدا حل نموده ، سپس با آب مقطر به حجم برسانیم.



عمل اکسین در گیاه:



ü نور گرایی



ü زمین گرایی



ü تشکیل لایه زاینده



ü عامل ریشه زایی



ü رشد سلول ها



ü غالبیت انتهایی



ü پارتنوکارپی یا تولید میوه بدون هسته



ü تنک کننده



سیتوکینین ها : بیشتر شامل مشتقات آدنین می باشد و نقش مهمی در القای ساقه زایی دارد. یادآور می شود که نسبت کم سیتوکینین به اکسین سبب ریشه زایی می شود. سیتوکینین ها را نیز در هیدروکسید سدیم یا هیدروکسید پتاسیم 0.1 مولار ابتدا حل نموده ، سپس با آب مقطر به حجم می رسانیم. از دو سیتوکینین مصنوعی ( کینیتین و بنزل آدنین) به وفور در کشت بافت استفاده می شود.لازم به ذکر است که سیتوکینین های مصنوعی در برابر نور و دما پایدار ترند.



عمل سیتوکینین ها:



ü سیتوکینز و تقسیم سلولی



ü تاخیر در وقوع پیری



ü ساقه زایی



ü تسریع جوانه زنی و شکستن خواب



ü ضد غالبت انتهایی



ü ضد تخریب کلروفیل



ü ایجاد پارتنوکارپی در برخی موارد



جیبرلین: همانطور که پیش تر گفته شد، از این مواد به اندازه اکسین ها و سیتوکینین ها در کشت بافت استفاده نمی شود. جیبرلین ها محلول در آب هستند و به صورت استوک 100X نگهداری می شوند.از معروف ترین جیبرلین ها ، GA3 می باشد که استفاده زیادی در باغبانی دارد.. این مواد نسبت به دما بسیار حساس هستند.



عمل جیبرلین:



ü جلوگیری از اندام زایی



ü افزایش فاصله میانگره ها



ü رشد طولی سلول ها



ü ایجاد پارتنوکارپی



آبسزیک اسید: استفاده چندانی در کشت بافت ندارد ولیکن در القای جنین زلیی سوماتیکی کاربرد دارد. معمولا آبسزیک اسید نقشی بازدارنده و منفی در گیاه دارد که با استفاده از ذغال فعال می توان آبسزیک اسید را حذف کرد.



عمل آبسزیک اسید:



ü ایجاد پیری زودرس



ü مشوق ایجاد خواب در بذور



ü ریزش برگ و میوه



اتیلن: هورمونی گازی شکل است که معمولا به محیط کشت اضافه نمی شود چون خود گیاه، پس از مدتی تولید اتیلن خواهد کرد.



◙ نکته: کشت اندام و کشت کالوس قادر به تولید اتیلن می باشند و همچنین ظروف پلاستیکی و شعله اتیلن تولید می کنندکه می توان با استفاده از پرمنگنات پتاسیم و پرکلرات جیوه [این دو ماده اسکرابر یا جاذب اتیلن هستند] اتیلن را از بین برد.



افزودن اتیلن به محیط کشت سبب تشکیل پیاز های نابجا در برخی گیاهان می شود. لازم به ذکر است که در برخی از کشت های سوسپانسیون سلولی ، 2,4,D ، اتیلن تولید می کند.



◄ چه مواقعی استوک تهیه می کنیم؟



برای عناصر ماکرو ، میکرو ، ویتامین ها ، هورمون های اکسین و سیتو کینین استوک می سازیم و برای قند هیچ وقت استوک تهیه نمی کنیم بلکه به صورت جامد ( پودر ) استفاده می کنیم.



آگار و مواد منعقد کننده



آگار با غلظتی حدود 0.6 تا 0.8 درصد و در مراحل انتهایی تهیه محیط کشت افزوده می شود. در کشت پروتوپلاسم از آگاروز به جای آگار استفاده می شود [درصد خلوص آگاروز بالاتر از آگار است و ژله آگاروز شفاف تر است].



از سایر مواد منعقد کننده می توان به ژل رایت و آلزینات را نام برد. ژل رایت با غلظتی حدودا نصف آگار به کار می رود و انعقاد آن بستگی به دادن حرارت و میزان کاتیون های نمک های دو ظرفیتی دارد.



◙ نکته مهم: در کشت مایع ( سوسپانسیون سلولی) که آگار افزوده نمی شود و همچنین در محیط کشت های جامدی که غلظت آگار کم است، عارضه شیشه ای شدن (Vitrification)بافت ها به دلیل تجمع آب در سلول ها رخ می دهد که در صورت ادامه داشتن، منجر به مرگ سلول ها می شود.



افزودن آگار بیش از حد، موارد زیر را موجب می شود :



o شیشه ای شدن کمتر می شود.



o ساقه های جانبی کمتر رشد می کنند.



o پتانسیل ماتریک تغییر می کند و جذب آب دچار اختلال می شود.



o جذب مواد غذایی کمتر می شود.



اسید های آمینه



افزودن اسید های آمینه به عنوان منبع ازتی در محیط کشت ضرورتی ندارد ولی در برخی از کشت ها نظیر کشت جنین ، اسید آمینه گلوتامین، افزوده می شود . همچنبن در برخی موارد برای از بین بردن مواد فنولی و دانه های رنگی از اسید های آمینه استفاده می شود.


◙ نکته مهم: تجمع مواد رنگی و فنولی در محیط کشت منجر به کاهش زشد ، عدم باز زایی و از بین رفتن گیاه می شود. برای حذف مواد فنولی و دانه های رنگی علاوه بر اسید های آمینه ، از ذغال فعال ، پلی وینیل پیرولیدون ، ویتامین ث استفاده می شود.

[hortilover]

همچنین محیط کشت مایع ، واکشت مداوم ، کاهش غلظت نمک ، کاهش تنظیم کننده های رشد و هورمون ها ، به حذف مواد رنگی و فنولی کمک شایانی می کند.


ترکیبات مکمل کمپلکس ، شامل تریپتون ها ، پپتون ها ، عصاره های مخمر ، عصاره های مالت ، شیر نارگیل، هیدرولیزات کازئین و.... به دلیل زیر محدود می باشد :
◘ این ترکیبات ، تقریبا نامشخص و بسیار متغیر هستند.
◙ نکته مهم: از ذغال فعال در موارد زیر استفاده می شود:
ü جذب پیگمان های رنگی مثل ملانین
ü جذب ترکیبات آلی مثل هورمون ها
ü تاریک کرئن محیط کشت که باعث افزایش تشکیل ریشه می شود.
ü تحریک جنین زایی سوماتیکی ( غیر جنسی)
ü تثبیت PH
ü افزایش رشد سلول ها
انواع محیط کشت
محیط کشت هایی که بیشتر مورد استفاده قرار می گیرند عبارتند از : M.S ، گامبورگ ، وایت ، ناب ، هلر، نیچ ، نیومن و ....غلظت نمک در محیط کشت M.Sبالا می باشد و در محیط کشت ناب کمترین غلظت نمک را شاهد هستیم.لذا در هنگام کشت گیاهان حساس به شوری ، از محیط کشت های هلر و ناب استفاده می کنیم و یا اینکه می توانیم غلظت نمک محیط کشتM.S را به نصف تقلیل داد. کاربرد و نوع محیط کشت مورد استفاده بستگی به نوع ، سن ، ریزنمونه دارد.
طریقه تهیه محیط کشت
برای این کار از محلول های استوک ( استوک عناصر ماکرو ، میکرو ، منیزیوم ، آهن ، ویتامین ها ، اکسین ، سیتوکینین ) بهره می گیریم. نحوه تهیه محیط کشت M.S بدین ترتیب است که ابتدا در یک ارلن مایر یک لیتری ، 800 سی سی آب می ریزیم، سپس با توجه با توجه به دستورالعمل های محیط کشت M.S، مقادیری از استوک عناصر ماکرو و میکرو را برداشته ، به همراه آب مقطر اضافه می کنیم. سپس استوک هورمون ها و ویتامین ها را اضافه می کنیم. باید توجه شود که هورمون ها و ویتامین های حساس به حرارت را پس از اتوکلاو نمودن محیط کشت ، اضافه کنیم.[ استوک ویتامین ها و هورمون ها از قبل توسط صافی استریل شده باشد].
پس از اجرای مراحل فوق ، قند را بصورت پودر و سایر مواد آلی اضافه می گردد. توجه شود که ارلن حاوی محیط کشت باید روی همزن مغناطیسی قرار گرفته باشد و دائما در حال تکان خوردن باشد.قبل از اینکه آگار (منعقد کننده) را اضافه کنیم باید PH را روی 5.5 تا 5.8 تنظیم کرد. [ عمل تنظیم PH با استفاده از هیدروکسید سدیم 0.1 مولار انجام می شود ]
عمل تنظیم PH بسیار مهم است چون اگر PH محیط کشت بالاتر از6 باشد، رشد مطلوبی صورت نمی گیرد و اگر PH خیلی پایین رود، اکسین و جیبرلین ناپایدار می شود، ویتامین تیامین ناپایدار ، محیط کشت آبکی و احتمال ویتریفیکاسیون بیشتر می شود. .
پس از تنظیم PH ، آگار را اضافه می کنیم ، البته دقت شود که قبل از اضافه کردن آگار ، حتما محیط کشت را حرارت دهید ( تا نزدیک نقطه جوش) تا حلالیت آگار بیشتر شود.
پس از اضافه کردن آگار ، توسط همزن مواد را مخلوط می کنیم تا تا محلولی شفاف به دست آید. حال محیط کشت را به درون ویال ها ( شیشه های مورد استفاده) انتقال می دهیم و نهایتا ویال ها را در دستگاه اتوکلاو ( به منظور استریل کردن) قرار می دهیم .
روش های استریل سازی در کشت بافت
کلیه مواد مورد استفاده ، دستگاه ها و هر آنچه که در حین عمل کشت بافت با آن سرو کار داریم را باید 100 درصد استریل کنیم. برای استریل سازی ریز نمونه از تیمار های شیمیایی استفاده می کنیم.
روش استریل سازی ریز نمونه:
ریزنمونه را توسط آب به خوبی شستشو می کنیم.پس از رفع آلودگی های ظاهری ریز نمونه را در الکل اتانول 70% به مدت 30 تا 60 ثانیه( بسته به نوع ریزنمونه) ، قرار می دهیم. اگر ریز نمونه بذر باشد ، مدت بیشتری نسبت به ریزنمونه برگ در الکل می گذاریم. (ریز نمونه خشبی نیز بیشتر در الکل باقی بماند) باید دقت شود که نگهداری ریز نمونه به مدت زیاد در اتانول ، ریزنمونه رشد و باززایی نمی کند.
سپس ریز نمونه را با آب مقطر می شوئیم ، در محلول هیپوکلریت سدیم ( وایتکس 1 تا 5 درصد ) به مدت 5 تا 30 دقیقه قرار می دهیم. سپس چندین بار ریز نمونه را با آب مقطر می شوئیم تا کاملا هیپوکلریت سدیم از ریزنمونه زدوده شود . حال ریز نمونه به درون هود لامینار انتقال می یابد
◙ نکته: در هنگام استریل سازی نمونه با هیپوکلریت سدیم ، از مواد کاهنده کشش سطحی ( یک قطره مایع ظرفشویی) استفاده می کنیم تا سطح تماس ریزنمونه با ماده ضدعفونی کننده افزایش یابد.
روش استریل کردن ظروف شیشه ای
بهتر است ظروف مورد استفاده پیرکس باشد چون که ظروف شیشه ای ارزان قیمت منجر به تولید مواد سمی می گردند.
ضدعفونی کردن ظروف توسط دستگاه اتوکلاو انجام میشود. سرعت و سهولت از بین بردن ویروس ها از مزایای اتوکلاو است. ظروف را به مدت 15 تا 30 دقیقه در دمای 121 درجه سانتیگرا د و در فشار 15 psiقرار می دهیم.
استریل کردن محیط کشت و محلول ها
عموما محیط کشت توسط اتوکلاو استریل می شود. ولی موادی را که توسط حرارت تجزیه می شوند ، با صافی استریل می کنند. شرایط 15 تا 30 دقیقه در دمای 121 درجه سانتیگرا د و در فشار 15 psi در اتوکلاو حکم فرماست . توجه شود که حجم های زیادتر محیط کشت را مدت زمان بیشتری در اتوکلاو می گذاریم. قند ها از جمله ساکاروز ، هورمون هایی مثل زآتین ، جیبرلین و اکثر ویتامین ها به حرارت حساس می باشند لذا توسط صافی آن ها را استریل می کنیم. هر چند ساکاروز را تا حدی می توان اتوکلاو نمود.
▼ توجه به نکات زیر در هنگام اتوکلاو نمودن محیط کشت ضروری است:
ü PH محیط کشت بعد از اتوکلاو نمودن ، 0.3 تا 0.5 کاهش می یابد یعنی محیط کشت کمی اسیدی تر می شود
ü اتوکلاو کردن طولانی مدت سبب رسوب برخی نمک ها و تجزیه آگار و قند ها می شود
ü مواد فرار از قبیل اتر ، اتیلن و ... در اثر اتوکلاو نمودن از بین می روند.
استرلیزاسیون لوازم فلزی از قبیل پنس و اسکالپل: این گونه وسایل را جهت ضد عفونی ، در دستگاه آون در دمای 170 تا 180 درجه سانتیگراد به مدت 3 ساعت قرار می گیرند .
با استفاده از ا اشعه ماوراء بنفش می توان هود لامینار را ضد عفونی کرد. همچنین کف هود لامینار را با الکل 96 درصد ضد عفونی می کنند . لازم به ذکر است که پنس ها ، چاقو ها و دیگر لوازم فلزی را در زیر هود لامینار دو بار در الکل 70 درصد به مدت چند ثانیه فرو می برند و سپس بر بروی شعله می گیرند تا کاملا استریل گردد.
اگر با وجود ضد عفونی و استریل سازی ریزنمونه ، آلودگی مشاهده شد یکی از عوامل زیر مسئول می باشند:
§ آلودگی های داخلی بافت
§ بی دقتی در کار و یا ضد عفونی نکردن میز یا هود لامینار
§ الکل آلوده
§ صحبت کردن در زیر هود لامینار
§ رفت و آمد زیاد بهاتاق کشت

[hortilover]

آلودگی ها داخلی
توسط استریل سازی با تیمار شیمیای برطرف نمی شوند و منجر به رشد ضعیف یا کلروز بافت های میش وند. این آلودگی ها اغلب در اثر باکتری های میله ای شکل ایجاد میشوند. دو راه برای مبارزه ، پیشنهاد می شود: اولا استفاده از آنتی بیوتیک در محیط کشت و ثانیا استفاده از کشت مریستم. لازم به ذکر است که به کاربردن آنتی بیوتیک به دلیل ایجاد مقاومت در باکتری ها ، هزینه زیاد و ایجاد سمیت گیاهی ، توصیه نمی شود.
مراحل اصلی انجام کشت بافت های گیاهی
1) تهیه ریز نمونه و استریل سازی آن
2) انتقال ریز نمونه به محیط کشت در زیر هود لامینار
3) رشد گیاه در محیط کشت تحت شرایط کنترل شده
4) واکشت کردن ریز نمونه ها
5) سازگار کردن ریزنمونه ها با شرایط برون شیشه ای (invivo)
6) انتقال گیاه به شرایط برون شیشه ای
جدا کردن و انتقال ریز نمونه استریل به درون محیط کشت
مقداری از ریز نمونه را بریده، در زیر هود لامینار به محیط کشت اضافه می کنیم. لوله های آزمایش و یا ظروف شیشه ای حاوی محیط کشت بایستی افقی نگه داشته شودو از قرار دادن ظروف محیط کشت بر روی شعله در حین انتقال نمونه خودداری شود، زیرا شعله تولید اتیلن می کند. معمولا بذور را بر روی سطح محیط کشت و اندام های گیاهی را درون محیط کشت قرار می دهند.

رشد گیاه در محیط کشت تحت شرایط کاملا کنترل شده
دمای محیطی که محیط کشت های حاوی ریز نمونه ها در آن قرار دارند، باید 24 تا 28 درجه سانتیگراد باشد ( البته در مواردی مانند گونه های پیاز دار ، شکستن خواب و یا جوانه زنی ، دمای کمتری را انتخاب می کتتد) .از لامپ های فلورسنت برای تامین نیاز نوری گیاه بهره می گیرند، نور بالاتر از 10000 لوکس مفید نمی باشد.چون نور زیاد، PH محیط کشت را پایین می آورد و محیط کشت را آبکی می کند.، دما را بالا می برد و اثرات منفی بر روی رشد گیاه ایجاد می کند.
در برخی موارد کنترل طول روزنیز حائز اهمیت است. فرایند هایی نظیر گلدهی و خواب به طول روز حساس هستند. تشعشع پایین را می توان با اضافه کردن قند به محیط کشت جبران کرد. رطوبت اتاق رشد ( گراس چمبر) در شرایط کنترل شده قرار دارد. هرچند به دلیل بسته بودن درب ویال ها ، رطوبت اتاق تاثیر چندانی بر محیط کشت ندارد.
اکسیژن مورد نیاز ریز نمونه را می توان با استفاده از سرپوش های فلزی برای ویال ها و همچنین قرار دادن ریز نمونه به صورت واژگون در محیط کشت ، استفاده از محیط کشت مایع ، تامین کرد.
واکشت کردن ریز نمونه ها
جدا کردن قطعه ای از ریز نمونه موجود در محیط کشت و کشت کردن مجدد آن در محیط کشت جدید را واکشت کردن می گویند. علت انجام این عمل عبارتست از:
ü کاهش مواد غذایی در محیط کشت اول
ü بالا رفتن غلظت نمک ها و خشک شدن محیط کشت اول
ü پر شدن فضا در اثر رشد گیاه در محیط کشت اول
ü ترشح مواد سمی و فنولی توسط گیاه به محیط کشت اول
ü کاهش PH و آبکی شدن محیط کشت اول
◙ نکته: گاهی اوقات هدف از واکشت کردن ، به همراه تغییر در میزان هورمون ها ی اکسین و سیتوکینین ، تولید اندام ریشه یا ساقه می باشد.
◙ نکته:گیاهانی که در شراسط درون شیشه ای رشد کرده اند ، ریشه های موئین بسیار کم و ضعیفی تولید کرده اند. یکی از بهترین کار هایی که به منظور توسعه ریشه ها استفاده می شود ، استفاده از محیط کشت مایع است.
سازگار کردن ریزنمونه ها با شرایط برون شیشه ای (invivo)
از آنجایی که ریز نمونه ها در شرایط درون شیشه ای با رظوبت بالا رشد کرده اند، بهببود مکانیسم باز و بسته شدن روزنه ها ، یکی از مهمترین فواید سازگاری گیاهان است در هنگام انجام عملیات سازگاری یا خودهی ، دما و نور را پایین و رطوبت را بالا نگه می داریم.
مراحل انتقال گیاه خو گرفته ، به شرایط برون شیشه ای
ü آگار از اطراف گیاه کاملا شسته شود.
ü انتقال به درون خاک کاملا استریل ( خاک را معمولا با آون ، بخار آب و یا اشعه استریل می کنند )
ü گیاهانی که در آنها پیاز های حقیقی یا کاذب وجود دار ، باید به فرم پیاز از ویال به درون خاک منتقل شود تا احتمال بقای گیاه بالاتر رود.
ü گاهی اوقات لازم است به منظور شکستن خواب گیاه ، بلافاصله پس از کشت گیاه در خاک به آن مقداری سرما بدهیم.

[hortilover]

ریز ازدیادی و مراحل آن ( Micro propagation )



تکثیر کلون ها ( سلول های مشابه که از طریق غیر جنسی به وجود آمده اند)در شرایط درون شیشه ای را ریز ازدیادی گویند. مراحل مختلف ریزازدیادی عبارتست از :



انتخاب ریز نمونه و استریل کردن آن و انتقال به محیط کشت



تولید و تکثیر ساقه از ریز نمونه



انتقال ساقه های تشکیل شده به محیط کشت برای ریشه دهی



سازگاری و انتقال به خاک



انواع روش های ریز ازدیادی



اندام زایی



تکثیر جوانه جانبی



جنین زایی سوماتیکی



اندام زایی یا ارگانوژنز



به دو روش مستقیم و غیر مستقیم انجام می شود. مستقیم از جوانه نابجا اندام تولید و در روش غیر مستقیم از کالوس ، اندام تولید می شود.



اندام زایی غیر مستقیم ( کشت کالوس)



معمولا ریز نمونه هایی دارای سلول های فعال میتوزی برای تولید کالوس مناسب هستند. بنابر این بافات های مریستمی برای این کار ارجح ترند.. هر چه ریز نمونه بزرگ تر باشد ، امکان اندام زایی بیشتر می شود. همچنین بهتر است ریز نمونه از بافت جوان ، عاری از بیماری انتخاب شود محیط کشت هایی مثل MS ،گامبورگ ، وایت برای اندام زایی مورد استفاده قرار می گیرند.



◙ نکته: محیط کشت مایع برای اندام زایی نسبت به محیط کشت جامد ارجحیت دارد چون در کشت مایع محیط کشت دائما به هم می خورد و شیب مواد غذایی یکسانی دارد. همچنین میزان تماس ریز نمونه با مواد غذایی و اکسیژن در کشت مایع بیشتر می شود.



به منظور اندام زایی غیر مستقیم در محیط کشت مایع، ابتدا قطعه ای از ریز نمونه را بر محیط کشت بدون آگار می گذاریم و شیشه را بر روی شیکر ( 150 تا 200 دور بر دقیقه) قرار می دهیم.و محیط کشت دائما در حال بهم خوردن باشد تا اینکه پس از 2 تا 4 هفته کالوس مشاهده شود.



نقش اصلی را در عمل اندام زایی هورمون ها بازی می کنند . مخصوصا اکسین و سیتوکینین که نسبت این ها ، تعیین کنننده نوع اندام ریشه یا ساقه می باشد. معمولا گیاهان تک لپه اکسین بیشتری به منظور القای کالوس نیاز دارند.



عوامل موثر در اندام زایی



• میزان هورمون اکسین و سیتوکینین



• غلظت نمک ها ، هر چه نمک ها بیشتر باشند اندام زایی نیز بیشتر می شود.



• غلظت یون آمونیوم نیز هر چه بیشتر ( البته نه خیلی زیاد ! ) باشد ، اندام زایی بیشتر می شود.



• گاهی عوامل فیزیکی مثل جریان الکتریسیته بین ریز نمونه و محیط کشت می تواند اندام زایی را تسریع کند.



اندام زایی مستقیم ( توسط جوانه نابجا )



در این روش ابتدا جوانه نابجا ابتدا تشکیل می شود و سپس از این جوانه ها اندام ها ی ریشه و ساقه نابجا تشکیل می شود. تکثیر جوانه جانبی شامل کشت مریستم انتهایی ، کشت تک گره و کشت جوانه جانبی می باشد.



کشت مریستم انتهایی



عموما از این روش برای تکثیر گیاهان عاری از ویروس استفاده می شود. زیرا که مریستم انتهایی فاقد ویروس می باشد. این روش به دلیل ضعیف بودن غالبیت انتهایی و بالا بودن قابلیت ریشه دهی در گیاهان علفی ، نسبت به گیاهان چوبی بیشتر موثر است.



کشت تک گره( جوانه)



دراین روش جوانه جانبی همراه باقطعه ای از ساقه جدا می شود. هدف از این کشت ، رشد اندام هوایی از جوانه می باشد



در این روش ، جوانه های تشکیل شده در زاویه دمبرگ ها و برگ های جوان را به عنوان ریز نمونه جدا می کنند و پس از تولید اندام رویشی و شاخه های کافی آن ها را ریشه دار نموده و نهایتا پس از مرحله سازگاری، آن ها را به خاک منتقل می کنند. توجه به نکات زیر، ضروری است:




 وقتی که با گباهان روزت مثل ژربرا یا گیاهان خانواده بروملیاسه سروکار داریم، یا زمانی که امکان آلودگی زیاد باشد، استفاده از روش کشت تک جوانه، امکان پذیر نیست. برای گیاهان روزت از روش کشت جوانه جانبی به جای کشت تک گره استفاده می کنند.



 بهترین جوانه ها برای کشت ، به منظور جلوگیری از آلودگی ، جوانه بسته می باشد.



 سرعت تکثیر یا ریز ازدیادی بستگی به تعداد جوانه های موجود بر روی گیاه اولیه دارد.



 در هنگام کشت تک جوانه ، خواب جوانه، ممکن است دردسر ساز شود . البته روش هایی برای شکستن خواب جوانه خصوصا برای گیاهان چوبی وجود دارد.که عبارتند از:



 تیمار با درجه حرارت پایین



 تیمار با روز بلند



 تیمار با جیبرلین و یا سیتوکینین



 اتیوله سازی ( تاریک کردن)



روش کشت جوانه جانبی



در این روش نوک ساقه جانبی را به عنوان ریز نمونه جدا می کنند . و گیاه اولیه را با غلظت زیاد سیتوکینین مواجه می کنند. غلظت بالای سیتوکینین، موجب توقف خاصیت غالبیت انتهایی شده و به جوانه های جانبی اجازه رشد می دهد.



پس از تولید تعداد زیادی جوانه جانبی ، هر کدام را می توان جدا کرده و به محیط کشت جدید حاوی سیتوکینین انتقال می دهیم. حتی الامکان از سرشاخه های کوچک و جوان استفاده کنید تا خطر بروز آلودگی ها کمتر شود.



◙ چند نکته مهم در مورد کشت جوانه جانبی



 غلظت سیتوکینین مصرفی در این روش به سن بافت ریزنومنه بستگی دارد بدین معنی که هر چه ریزنمونه جوان تر باشد، سیتوکینین کمتری می طلبد.



 اغلب گیاهان به سیتوکینین بنزل آدنین نسبت به سایرین، واکنش بهتری دارند.



 نسبت سیتوکینین به اکسین را معمولا 10 به 1 در نظر می گیرند.



 استفاده از کشت سوسپانسیون سلولی گاهی اوقات تشکیل ساقه های جانبی را تسریع می کند.



 از دو ترکیب فنیل اوره و تیدیازورون، به عنوان جایگزین های سیتوکینین می توان بهره گرفت.



جنین زایی سوماتیکی



هر یک از سلول های کیسه جنینی و یا بافت اسپورفتیک پیرامون آن ، قابلیت تبدیل شدن به جنین را دارا می باشند.



جنین زایی سوماتیکی با اندام زایی متفاوت است زیرا در جنین زایی ، جنین فقط از یک سلول به وجود می آید و فاقد ارتباط آوندی با بافت کالوس میباشد. و جنین زایی سوماتیکی به یک محرک هورمونی (2,4,D) نیاز دارد ، در حالی که در اندام زایی به دو محرک هورمونی ( اکسین و سیتوکینین ) نیاز است.



عوامل موثر بر جنین زایی سوماتیکی



برای القای جنین زایی ، 2,4,D لازم است ولیکن برای رشد جنین 2,4,D ر احذف می کنیم.



جیبرلین مانعی در تولید جنین در این روش می باشد.



کاهش یون آمونیوم ، پتاسیم، کلسیم به تولید بهتر جنین کمک می کند.



غلظت بالای نمک ها ، نور و دمای زیاد جنین زایی را تسریع می کند.



غلظت ساکاروز برای جنین زایی سوماتیکی حدود 2 تا 3 درصد باشد.



شیرنارگیل باعث تسریع جنین زایی می شود.



◙ نکات مربوط به جنین زایی سوماتیکی



در برخی از گیاهان مثل هویج می توان از تمامی اعضای گیاه به منظور جنین زایی استفاده کرد ولی در برخی از موارد فقط اندام خاصی از گیاه را باید تکثیر کرد.



اندام های زایشی و بافت گل ، ریز نمونه های خوبی برای جنین زایی سوماتیکی هستند.



▼ چرا از جنین زایی سوماتیکی ، در ریز ازدیادی کمتر استفاده می شود؟



احتمال بروز جهش در جنین زایی سوماتیکی بالاست.



تکثیر به وسیله این روش دشوار است.



ممکن است گاهی در جنین زایی سوماتیکی ، جنین به خواب رود که شکستن آن بسیار دشوار است.

[hortilover]

بذور مصنوعی
یکی از مهمترین موارد استفاده از جنین زایی سوماتیکی ، تولید بذور مصنوعی است. بذر مصنوعی عبارتست از یک جنین سوماتیکی به همراه یک آندوسپرم مصنوعی و یک پوشش مصنوعی برای حفاظت از بذر.
نقش آندوسپرم را ترکیباتی چون هیدروژل ، آگار ، آلژینات سدیم ، آلژینات پتاسیم و یا کاراجینان را ایفا می کنند . و برای پوشش بذر از کلرید کلسیم ، کلرید کبالت ، کلرید آهن ، دکستران و یا گزانتام استفاده می کنند. معمولا در صنعت از آلژینات سدیم به عنوان آندوسپرم و از کلرید کلسیم به عنوان پوشش بذر استفاده می شود.
مشکلات تهیه بذر مصنوعی
o نیاز به روش های فیزیکی و شیمیای جهت غیر فعال کردن جنین دارد.
o بذور مصنوعی محتاج به محافظت در برابر خشک شدن هستند.
o بازیافت گیاهان حاصل از این بذور دشوار است. دلیل این امر یکی به خاطر تشکیل جنین ناقص و دیگری به دلیل ایجاد آندوسپرم مصنوعی است.
o تولید آن هزینه بالایی دارد.
▼ چرا از روش بذور مصنوعی استفاده می کنیم؟
· مهمترین مزیت استفاده از این روش ، صرفه جویی در زمان می باشد. زیرا تولید بذر مصنوعی در مدت چند روز تاحد اکثر چند ماه به دست می آیند.
مزایای ریز ازدیادی
· به مقدار بسیار کمی از بافت گیاه به عنوان ریز نمونه ، نیاز می باشد.
· در برخی از گونه ها که به روش های رایج ، ازدیاد نمی شوند ، ریز ادیادی روش مناسبی است.
· در هر فصلی از سال قابل اجراست و تغییرات فصلی تاثیری در اجرای آن ندارد.
· توسط این روش گیاهان عاری از ویروس حاصل می شوند.
معایب ریز ازدیادی
o به تجهیزات گران و پیچیده نیاز دارد.
o امکان آلودگی گیاه توسط پاتوژن ها زیاد است.
o تغییرات ژنتیکی از جمله تنوع سوماکلونال ممکن است مشاهده شود که گاهی اثرات نامطلوبی بر جای می گذارد.
o امکان دارد برخی پیده های منفی نظیر شیشه ای شدن و یا پرپشت شدن رخ دهد



کشت مریستم و روش های ایجاد گیاهان عاری از ویروس
همانطور که قبلا نیز ذکر شد یکی از روش های مبارزه با آلودگی های درونی ، کشت مریستم می باشد که شامل 6 روش می باشد.
1. استفاده از گرما
2. کشت مریستم
3. تلفیق گرما و کشت مریستم
4. تشکیل جوانه نابجا و اندام هوایی و سپس کشت مریستم
5. کشت کالوس و پروتوپلاست
6. پیوند مریستم روی پایه های عاری از ویروس
استفاده از گرما
به نظر می رسد که گرما فقط علیه ویروس های ایزومتریک . بیماری های ناشی از مایکوپلاسما موثر است و گاهی گرما روی برخی ویروس ها کاملا بی اثر است. استفاده از این روش برای درختان میوه ای که به کشت مریستم جواب نمی دهند، مناسب می باشد.درجه حرارت مورد استفاده به نوع گیاه بستگی دارد ( بین 35 تا 38 درجه سانتیگراد) و زمان آن بین 20 تا 40 روز توصیه می شود.
◙ نکته مهم : این روش برای گیاهان کشت شده در شرایط درون شیشه ای مناسب است و طبیعی است که گیاهان در شرایطinvivo قادر به تحمل چنین گرمایی، نیستند !
کشت مریستم: فرضیه های مختلفی در باره عدم وجود در مریستم ها گزارش شده است، از جمله:
1. در هنگام تقسیم سلولی ، گیاه ظرفیت برای سنتز اسید های نوکلئوتیک، به مصرف خود گیاه رسیده درنتیجه ویروس ها نمی توانند تکثیر شوند.
2. فقدان بافت های آوندی در مریستم و همچنین فقدان فضای سلولی مانع انتقال ویروس می شود.
3. آنزیم های مورد نیاز برای تکثیر ویروس در مریستم ها وجود ندارد.
4. غلظت کم ویروس ها در مریستم در نتیجه وجود برخی بازدارنده های طبیعی است.
نحوه کشت مریستم بدین صورت است که ابتدا قسمت انتهایی اندام هوایی ( مریستم ) را جدا می کنیم و بر روی محیط کشت قرار می دهیم.در هنگام جدا کردن ریز نمونه اگر مریستم فعال باشد ، شانس حذف ویروس بیشتر می شود. معمولا مریستم را همراه با یک تا دو جوانه آغازین برگ ، توسط اسکالپل قطع می کنیم شانس موفقیت کشت مریستم به نوع و موقعیت جوانه ها و همچنین فصل رشدی که ریز نمونه جدا می شود بستگی دارد.یعنی مثلا اگر در بهار ، مریستم ها را جدا کنیم ر به خوبی گیاهان عاری از ویروس و تولید می شود.
ترکیبات محیط کشت برای کشت مریستم
معمولا مریستم ها در محیط کشت جامد کشت می شوند. PHمحیط کشت 5.4 تا 6 می باشد. از ویتامین های تیامین (B1) ، پیرودوکسین (B6) ، اسید نیکوتینیک (B3) و... در محیط کشت استفاده می شود .
هورمون با غلظت کم ( معمولا اکسین و سیتوکینین ) وساکاروز 2 تا 5 درصد استفاده می شود. درجه حرارت ه.ا ، 21 تا 25 درجه سانتیگراد ( البته در کشت مریستم گیاهان غده ای حرارت پایین تری انتخاب می شود)
استفاده تلفیقی از گرما و کشت مریستم
زمانی که بیش از یک نوع ویروس وجود داشته باشد از این روش بهره می گیریم. اغلب از گرما در ابتدای کشت مریستم استفاده می شود . طول دوره استفاده از گرما ( بین 35 تا 38 درجه سانتیگراد) معمولا بین 5 تا 10 هفته متغیر است.در این روش ابتدا از گرما استفاده می شود سپس از گیاهی که دوره گرما را سپری کرده است ، مریستم به عنوان ریز نمونه جدا می شود.
تشکیل ساقه یا جوانه نابجا و کشت مریستم
تشکیل جوانه نابجا و در نهایت ساقه نابجا برای بدست آوردن گیاهان عاری از ویروس بکار می رود. جدا کردن مناطق عاری از ویروس از گیاه و تولید ساقه های نابجا منجر به ایجاد گیاهانی عاری از ویروس می شود.
کشت کالوس و پروتوپلاست
می توان با جدا کردن قسمت های عاری از ویروس از گیاه ،کالوس یا پروتوپلاست های عاری از ویروس به دست آورد. البته باید دقت شود که گیاهان عاری از ویروس حاصل از کشت کالوس و کشت پروتوپلاست ، به دلیل موتاسیون ها و تغییرات زیاد، اهمیت کاربردی چندانی ندارند.
ریز پیوندی (پیوند مریستم روی پایه های عاری از ویروس) (Micro Grafting)
چنانچه امکان القای رشد مریستم یا تولید ریشه از ساقه حاصل از کشت مریستم وجود نداشته باشد، از ریز پیوندی بهره می گیریم. ریز پیوندی در گونه های چوبی بسیار مهم است چون در این گروه از گیاهان کشت مریستم امکان پذیر نمی باشد.
کشت جنین
عبارتست از جدا کردن و رشد دادن یک جنین نارس ، نابالغ و یا بالغ کاملا استریل در شرایط درون شیشه ای که هدف از انجام اینکار تولید یک گیاه کامل می باشد. اولین بار دانشمندی به نام هانیگ در سال 1904 توانست با استفاده از کشت جنین گیاه بدست آورد. به طور کلی دو نوع کشت جنین وجود دارد. کشت جنین بالغ و کشت جنین نا بالغ.
کشت جنین نابالغ
معمولا برای جلوگیری از سقط جنین نارس انجام می شود و به یک محیط کشت بسیار پیچیده نیاز دارد. احتمال موفقیت بستگی به مرحله نمو جنین دارد.
کشت جنین بالغ
برای رفع موانع جوانه زنی بذر از این روش استفاده می شود. جنین های بالغ بر روی محیط کشت قرار می گیرند و به یک محیط کشت ساده نیاز دارد.

[hortilover]

مشخصات جنین در شرایط درون شیشه ای ، نسبت به برون شیشه ای پس از مرحله گلوبولار به صورت زیر است:
 جنین در شرایط درون شیشه ای رشد حجمی بیشتری دارد و گلابی شکل است.
 در شرایط درون شیشه ای ، در ابتدا تنها یک لپه وجود دارد در حالیکه در شرایط برون شیشه ای به طور همزمان ممکن است دو لپه موجود باشد.
 جنین های جدا شده در شرایط درون شیشه ای معمولا زود تر از موعد جوانه می زنند. این امر به دلیل عدم وجود پوسته بذر و مواد بازدارنده جوانه زنی در کشت درون شیشه ای است.
عواملی که در موفقیت کشت جنین دخالت دارند عبارتند از:
ژنوتیپ : در برخی از گونه ها و ژنوتیپ های گیاهی رشد جنین آسان می باشد و در برخی دیگر رشد جنین مشکل است.
مرحله نمو جنین هنگام جداسازی : جنین های بسیار کوچک و تمایز نیافته معمولا در برون شیشه رشد نمی کنند و جنین های تکامل یافته در شرایط برون شیشه راحت تر رشد می کنند.
شرایط رشد گیاه مادری : بهبود رشد گیاه مادری که جنین را از آن جدا می کنیم منجر به نمو و رشد بهتر آندوسپرم و همچنین رشد بهتر لپه ها می شود که نهایتا رشد جنین بهتر خواهد شد.
ترکیب محیط کشت: همانطور که قبلا ذکر شد، جنین نابالغ نسبت به جنین بالغ نیاز به محیط کشت پیچیده تری دارد. اگر جنین بالغ باشد از غلظت 2 تا 3 درصد و اگر جنین نابالغ باشد ، از غلظت 8 تا 12 درصد استفاده می کنیم.
◙ نکته : میزان نیاز قند با بزرگتر شدن جنین در واکشت های بعدی کاهش می یابد.
◙ نکته : از هورمون های اکسین و سیتوکینین در کشت جنین استفاده نمی کنیم زیرا این هورمون ها اندام زایی می کنند و به جای اینها می توان از جیبرلین بهره گرفت که باعث تسریع در جنین زایی می شود.
◙ نکته: در محیط کشت از موادی مثل شیر نارگیل ، هیدرولیزات کازئین و عصاره مالت استفاده می شود که برای رشد جنین های نابالغ مفید می باشند.
◙ نکته: وجود گلوتامین برای رشد جنین های نابالغ ضروری است . معمولا اسید مالیک نیز به محیط کشت جنین اضافه می شود.
پس از یک تا دو هفته که رشد جنین انجام شد ، جنین از رشد باز می ایستد و باید جنین را واکشت نمود و به محیط کشت جدیدی که محتوی مقدار قندی آن در حد معمول و مقدار کمی اکسین و سیتوکینین است ، انتقال می دهیم ( در محیط کشت اولیه از اکسین و سیتو کینین استفاده نمی کنیم ) در این حالت در بیشتر موارد به طور مستقیم ساقه و اندام های هوایی تشکیل می شود . در برخی موارد که جنین به تشکیل مستقیم ساقه نمی پردازد، باید ریز نمونه را به محیط کشت دیگری منتقل کرد.
اکسیژن : در برخی از موارد نیاز کشت جنین به اکسیژن بیش از غلظت موجود در هواست که باید نسبت به اضافه کردن اکسیژن به محیط اقدام کرد.
نور: در برخی از موارد لازم است که جنین های جدا شده به عنوان ریز نمونه به مدت یک تا دو هفته در تاریکی بگذرانند و پس از آن به منظور تشکیل کلروفیل در روشنایی قرار می گیرند.
درجه حرارت : درجه حرارت معمولا به گونه جنین بستگی دارد. معمولا برای کشت جنین درجه حرارت نسبتا بالا ی 25 تا 28 درجه استفاده می شود.
موارد کاربرد کشت جنین
 رفع موانع جوانه زنی بذور
 کوتاه کردن دوره اصلاح گیاهان با رفع خواب بذر
 تولید گیاهان هاپلوئید
 جلوگیری از سقط جنین در درختان هسته دار زودرس مثل گیلاس ، آلبالو ، زرد آلو.
 جلوگیری از سقط جنین در اثر ناسازگاری حاصل از تلاقی های بین گون های.
 تکثیر رویشی ، گاهی از جنین به عنوان ماده اولیه برای تکثیر رویشی استفاده می شود که این حالت بیشتر در خانواده گندمیان و مخروطیان امکان پذیر است.
کشت سوسپانسیون سلولی
در این نوع کشت ها ، ریز نمونه استریل از قبیل جوانه ، جنین یا بافت ، درون محیط کشت مایع قرار داده می شوند. نحوه عمل بدین صورت است که ابتدا قسمتی از بافت را جدا کرده و به آرامی در محیط کشت مایع رها می کنیم و تحت تاثیر آنزیم های پکتیناز موجود در محیط کشت ، قرار می دهیم.( نقش این آنزیم انحلال پکتین در دیواره سلولی است) لازم به ذکر است که از محیط های کشت M.S ،LS ، Blaydez ، B5 ، استفاده می کنیم.و این محیط کشت ها برای هوادهی دائما روی شیکر قرار دارند. به منظور واکشت کردن از دو روش استفاده می کنیم:
1. قبل از واکشت ، سوسپانسیون را از درون صافی های استریل عبور می دهیم.
2. اجازه دهیم برخی مواد در محیط کشت اولیه رسوب نمایند سپس با استفاده از پی پت موادی که هنوز به صورت سوسپانسیون هستند را به محیط کشت جدید انتقال دهیم.
سلول های کشت سوسپانسیون سلولی و همچنین کالوس ، در هنگام رشد خود، 5 مرحله زیر را طی می کنند:
1. مرحله خفته
2. مرحله تصاعدی
3. مرحله رشد خطی
4. مرحله کند شدن رشد
5. مرحله سکون
زمان مضاعف سدن سلول ها در کشت های سوسپانسیون سلولی از 24 تا 48 ساعت متغیر است و معمولا نباید بیش از 20 درصد حجم ظرف را پر کرد.

[hortilover]

انواع کشت سوسپانسیون سلولی
 کشت بسته
 کشت مداوم که خود شامل دو دسته می شود:
کشت مداوم باز
کشت مداوم بسته
کشت بسته:
در این روش محیط کشت تجدید نمی شود.
کشت مداوم باز :
در این نوع سیستم محیط کشت تجدید می شود و همزمان با تجدید محیط کشت سلول ها هم برداشت می شوند.
سیستم کموستات : در این سیستم با ثابت نگه داشتن نیتروژن ، فسفر و گلوکز، مقدار رشد وتراکم سلول ثابت نگه داشته می شود و سایر مواد در حد متعادل نگه داشته می شوند.
سیستم توربیدوستات : در این سیستم ، محیط کشت با توجه به میزان کدری آن ، جایگزین می شود و تراکم سلول با استفاده از برداشت سلول ها از محیط کشت ثابت نگه داشته می شود.
محیط کشت مداوم بسته:
در این حالت محیط کشت تجدید می شود ولیکن سلول ها برداشت نمی شوند.
همزمان سازی کشت سوسپانسیون سلولی به منظور تولید متابولیت های ثانویه
یک کشت همزمان کشتی است که در آن کل چرخه سلولی و یا یک مرحله خاصی از چرخه سلولی اکثر سلول ها همزمان اتفاق می افتد. این همزمان کردن سبب یکنواختی رشد سلول ها می شود . روش زیر برای ایجاد همزمانی در کشت سوسپانسیون سلولی توصیه می شود:
 سرما دادن: قرار دادن محیط کشت در یخچال به مدت چند روز.
 گرسنگی دادن : کاهش دادن یا قطع یک فاکتور ضروری رشد که منجر به ایجاد فاز سکون می شود و سپس فراهم کردن مجدد همان فاکتور که موجب همزمانی مراحل رشد سلولی می گردد.
 استفاده از بازدارنده های شیمیایی مثل هیدروکسی اوره و ...
 استفاده از موادی نظیر کلشی سین که منجر به توقف رشد سلول ها در مرحله متافاز می شود.
تکنیک کشت تک سلول ( تکنیک برگمن در محیط کشت جامد)
برگمن در سال1960 برای اولین بار پخش سلول های کشت سوسپانسیون بر سطح محیط کشت آگار را ابداع کرد. در این روش سوسپانیون سلولی و آگار ، به طور جداگانه و هر یک با غلظت دو برابر تهیه می شود سپس مقادیر مساوی از سوسپانسیون سلولی و آگار در دمای 38 درجه سانتیگراد با هم ترکیب و سریعا به پتری دیش منتقل می شوند. به نحوی که سلول ها در لایه نازکی به ضخامت یک میلیمتر، پخش می شوند.
سوسپانسیون سلولی محیط کشت برگمن باید حتما رقیق باشد و پس از آن ظرف شیشه ای را با پارافین بسته و پتری دیش را در دمای 25 درجه سانتیگراد به مدت سه هفته درون انکوباتور قرار می دهیم.
کاربرد های کشت سوسپانسیون سلولی
 امکان تکثیر گیاهان مشابه را فراهم می کند
 از این نوع کشت جهت مطالعه و تحقیق بر روی سلول ها استفده فراوانی می شود.
 از تنوع سوماکلونال اتفاق افتاده در کشت سوسپانسیون سلولی جهت تولید گیاهانی با خصوصیات جدید بهره می برند.
 منبعی برای تولید متابولیت های ثانویه به شمار می آیند.
متابولیت های ثانویه
موادی هستند که مورد استفاده گیاهان واقع نمی شوند و نیز وارد سیکل های حیاتی گیاه وارد نمی شوندو اصلا فعالیت فیزیولوژیکی در گیاه انجام نمی دهند اما به منظور دفع آفات ، جذب حشرات و مبارزه با بیماری های گیاهی تولید می شوند.
بیوترانسفورماسیون
تغییر و تبدیل یک ماده بی ارزش به یک ماده مهم صنعتی با استفاده از سیستم های بیولوژیکی (کشت بافت و کشت سوسپانسیون سلولی) را بیوترانسفورماسیون گویند. سلول های گیاهی معمولا به دو روش در بیوترانسفورماسیون مورد استفاده قرار می گیرند:
1. استفاده از کشت سوسپانسیون سلولی و اضافه نمودن ماده بی ارزش به محیط کشت و سپس برداشت محصول از محیط کشت پس از مدت زمان مناسب.
2. بی تحرک کردن سلول های گیاهی ( تثبیت سلول ها ) در ستون های حاوی ماتریکس ژله مانند ( جنس این ژل آلژینات سدیم یا پتاسیم است ). سوبسترا یا ماده بی ارزش از بخشی وارد ماتریکس می گردد و از طرفی دیگر ماده مورد نظر استخراج می شود.
مهم ترین واکنش هایی که سلول های گیاهی در بیوترانسفورماسیون انجام می دهند عبارست از: هیدروکسیلاسیون ، اکسیداسیون و احیا ، هیدرولیز ، گلیکولیزاسیون ، ایجاد باند مضاعف.
تولید گیاهان هاپلوئید با استفاده از کشت بساک و کشت تخمک
روش تولید گیاهان هاپلوئید در شرایط برون شیشه ای با استفاده از عوامل زیر صورت می گیرد:
• بکرزایی
• نرزایی یا آندروژنز
• حذف ژنوم در تلاقی های دور
• سمی گامی
• تیمار شیمیایی مثل کلشیسین،مائیک هیدرازید و...
• درجه حرارت های بالا و پایین
• اشعه ایکس و ماورا بنفش
تولید گیاهان هاپلوئید در شرایط درون شیشه ای با استفاده از عوامل زیر صورت می گیرد:
• کشت بساک
• کشت دانه گرده
• کشت گل آذین
• کشت تخمک
• کشت جنین
کشت بساک
جداسازس بساک و استریل نمودن و قرار دادن آن بر روی محیط کشت را کشت بساک می نامند.بساک به عنوان ریز نمونه هنگامی جدا می شود که اولین تقسیم میتوز در دانه گرده رخ نداده است. و یا اینکه بساک دارای میکروسپور های تک هسته ای بین باشند.گیاهان هاپلوئید را می توان به دو روش از بساک های استریل تولید نمود. یکی روش مستقیم و دیگری روش غیر مستقیم. در روش مستقیم از دانه گرده ، مستقیما جنین به دست می آید .در روش غیر مستقیم ابتدا از دانه گرده کالوس تولید می شود سپس جنین یا ساقه نابجا تولید می شود. لازم به ذکر است که روش غیر مستقیم به دلیل تولید سطوح مختلف پلی پلوئیدی روش مناسبی نمی باشد.
کشت دانه گرده:
جداسازی دانه گرده ( میکروسپور ) از درون بساک و کشت آن در شرایط درون شیشه را کشت دانه گرده گویند. روش جدا سازی دانه گرده از بساک کمی مشکل است و شامل مراحل زیر است:
Ø ابتدا بساک ها را در مرحله مناسب جدا می کنند و با یک میله شیشه ای خمیده له می کنند. در این حالت دانه های گرده از بساک خارج می شوند.
Ø در این مرحله سوسپانسیون بساک ها به همراه دانه های گرده از صافی گذرانده می شوند.( قطر منافذ این صافی کمی بیش تر از قطر دانه گرده است)
Ø سوسپانسیون محتوی دانه گرده با دور کم 150 به مدت 5 دقیقه سانتریفیوژ می شوند.و فاز رویی که محتوی مواد زاید می باشد به دور ریخته می شود.
Ø دانه های گرده رسوب کرده بر روی یک محیط کشت مناسب قرار داده می شوند. در نهایت سوسپانسیون حاصل با پیپت به پتری دیش منتقل می شود.
عوامل موثر در در موفقیت کشت دانه گرده و بساک
o ژنوتیپ گیاه
o وضعیت فیزیولوژیکی گیاه والدی که از آن ریز نمونه گرفته می شود.
o مرحله رشد دانه گرده در هنگام جداسازی
o پیش تیمار بساک ها که شامل پیش تیمار سرمایی و پیش تیمار گرمایی و یا پیش تیمار شیمیایی می شود.
o محیط کشت که معمولا از درصد بالایی ، قند، گلوتامین ، نیترات و نمک ها آمونیومی ، ذغال فعال ، آهن و ... تشکیل شده است.

[hortilover]

مزایای کشت گرده نسبت به کشت بساک
 افزایش شانس باززایی گیاهان هاپلویید در کشت دانه گرده
 با حذف بساک مواد بازدارنده رشد و آبسزیک اسید حذف می شوند.
 در کشت دانه گرده ، بساک ها به عنوان مانع انتقال مواد غذایی از محیط کشت به دانه گرده نمی توانند اثری داشته باشند.
 امکان بروز شیمر در کشت دانه گرده کمتر استو
 برای القای موتاسیون و دست ورزی های ژنتیکی کشت دانه گرده مهم تر از کشت بساک می باشد.
 تشکیل جنین در کشت دانه گرده راحت تر و بهتر از کشت بساک است.
کاربرد های هاپلوئید ها
امکان رسیدن سریع به هموزیگوسیتی با ایجاد دبل هاپلوئید فراهم می شود.
امکان رسیدن سریع به هموزیگوسیتی در گیاهان در گیاهان با دوره گلدهی طولانی فراهم می شود.
.امکان تولید هیبرید های F1 یکنواخت فراهم می شود.
حصول هاپلوئیدی به منظور آسان کردن مطالعات توارث و خصوصیات مطلوب
تولید گیاهان نر در باغبانی امکان پذیر می شود. مثلا در مارچوبه عملکرد بوته های نر بیشتر است.
برای انجام هیبریداسیون سوماتیکی ، کار کردن با پروتوپلاست های هاپلوئید راحت تر از کار کردن با پروتوپلاست های دیپلوئید می باشد.
استفاده از تنوع سوماکلونال اتفاق افتاده در کشت بافت و ایجاد گیاهانی مقاوم به حشرات و ...
کشت تخمک
برای تولید گیاهاان هاپلوئید در گونه هایی که با کشت دانه گرده نتایج نامطلوبی چون آلبینیسم را به همراه دارد، یا مانند ژربرا با نارسایی همراه است، می توان از کشت تخمک یا تخمدان بهره گرفت. برای تولید گیاه هاپلوئید با استفاده از کشت تخمدان ، تخمک های بارور نشده جوانه گل ، 24 الی 48 ساعت قبل از گرده افشانی طبیعی جدا می شوند.قبل از کشت بخش انتهایی دمگل بریده می گردد وتخمدانرا از سمت بریده شده در محیط کشت قرار می دهند.
در کشت تخمدان معمولا از محیط کشت های وایت و نیچ و یا N6 استفده می کنند .مهمترین عیبی که این تکنیک دارد اینست که نسبت به کشت میکروسپور که تعداد بیشماری دانه گرده دارد، در هرگل فقط یک تخمدان وجود دارد..
کشت پروتوپلاست
در این کشت، پروتوپلاست جدا شده و در شرایط درون شیشه ای کشت می شود معمولا از سلول های مزوفیل برگ استفاده می شود در برخی از موارد از کشت سوسپانسیون سلولی برای تولید پروتوپلاست استفاده می گردد.در این صورت سلول ها در مرحله رشد تصاعدی برداشت می شوند. پس از انتخاب سلول ها ، دیواره سخت سلولزی را از بین می برند به منظور خالص کردن پروتوپلاست ها از ***** ها و سپس برای ته نشین کردن پروتوپلاست ها از سانتریفیوژ استفاده می کنند ( سانتریفیوژ مکرر با دور کم و در محلول ساکاروز 15 الی 20 درصد انجام می شود) سپس پروتوپلاست های جدا شده به منظور واکشت در محیط کشت جدیدی قرار داده می شوند.لازم به ذکر است که در محیط کشت نباید از آمونیوم استفاده کرد چون بقای پروتوپلاست را به مخاطره می اندازد. مقدار کلسیم در محیط کشت افزوده و از مقدار آهن و روی کاسته می گردد.معمولا غلظت اکسین را بالا تر و سیتو کینین را کم تر می کنند و محیط کشت را در تاریکی قرار می دهند.
امتزاج پروتوپلاست
یکی از مهمترین استفاده های کشت پروتوپلاست استفاده از آن در دو رگ های سوماتیکی و امتزاج پروتوپلاست است.
معمولا به منظور امتزاج پروتوپلاست ها ، دو گونه از طریق انکوباسیون پروتوپلاست ها در غلظت بالای PEG و در غلظت بالای کلسیم و همچنین محیطی قلیایی انجام می گیرد. به دلیل وجود بار های منفی در سطح پروتوپلاست دو گونه مختلف معمولا امتزاج آنها به سختی انجام می شود.که برای جلوگیری از این امر از موادی موسوم به فوزیژن ها ( شامل نیترات سدیم و کلرید کلسیم) استفاده می شود.ممکن است از روش الکتروفیوژن استفاده شود که در این روش ابتدا با شدت جریان کم، ابتدا پروتوپلاست ها به هم اتصال پیدا می کنند سپس با افزایش شدت در زمان کم ، عمل امتزاج روی می دهد.
پس از عمل امتزاج نوبت به باز زایی دیواره سلولی پروتوپلاست هیبرید می شود.بدین منظور باید غلظت کلسیم در محیط کشت را زیاد و پتانسیل اسمزی را کم کنیم.. بعد از چند روز که دیواره سلولی باز زایی شد ، پتانسیل اسمزی را به تدریج افزایش می دهیم تا به حد نرمال برسد. اگر پروتوپلاست ها از دو ژنوتیپ مختلف با هم ، امتزاج یابند هتروکاریون و اگر دو پروتوپلاست مشابه با هم امتزاج یابند، هوموکاریون حاصل می شود.
سیبرید ها
امتزاج بین هسته و سیتوپلاسم یک گونه با فقط سیتو پلاسم پروتوپلاست دیگر را سیبرید گویند. در ایجاد نر عقیمی ، مقاومت به بیماری و مقاومت به علفکش ها استفاده می شود

[hortilover]

اهمیت .و کاربرد هیبریداسیون سوماتیکی
ü امکان تهیه هیبرید هایی که به روش معمولی نمی توانند به وجود بیایند.
ü تولید هیبرید در گیاهانی که اندام های جنسی در آنها غیر فعال است
ü تولید هیبرید در گیاهانی که هنوز در سن نونهالی هستند و یا به گل نرفته یا دیر گل هستند.
ü با استفده از این روش می توان اطلاعات موجود در والد نر ( ژن مقاومت به بیماری ها و...) را به نتاج منتقل کرد



تنوع سوماکلونال
به تنوع و تغییرات ژنتیکی و کروموزومی ایجاد شده در کشت بافت تنوع سوماکلونال گویند. به گیاهان جدید و مقاومی که در اثر تنوع سوماکلونال به وجود می آیند واریانت گفته می شود. توجه شود که ایجاد واریانت جدید تنها در مورد صفات و ژن هایی نظیر مقاومت به بیماری ها و علفکش ها پاسخ مثبتی داده است و در مورد سایر صفات همیشه به صورت مفقیت آمیز نبوده است.







منابع:
- مبانی کشت بافت گیاهی تالیف R.L.M ترجمه دکتر باقری و همکاران
- اصول بیوتکنولوژی گیاهی تالیف H.S

[sholeh_rezai]

سلام خوبید؟
میتونید در مورد دلایل شیشه ای شدن گیاهان کشت بافتی و طریقه درست کردن محیطی که این گیاهان را به حالت طبیعی برگردونه اطلاعاتی برام بفرستید ممنون میشم.